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“溶菌酶”检测方法

时间:2010-10-03 06:59来源:未知 作者:华盈农牧 点击:
“溶菌酶”检测方法,本品在水中易溶,在丙酮,乙醚中不溶.取本品10mg,溶于1ml水中,加30%三氯醋酸2滴,产生白色沉淀.或取试管一支,加5%溶菌酶水溶液2滴,10%氢氧化钠5滴及1%硫酸铜溶液1滴,混匀后,应显
本品在水中易溶,在丙酮,乙醚中不溶。
【鉴别】
(1)取本品10mg,溶于1ml水中,加30%三氯醋酸2滴,产生白色沉淀。
(2)取试管一支,加5%溶菌酶水溶液2滴,10%氢氧化钠5滴及1%硫酸铜溶液1滴,混匀后,应显紫玫瑰色。
【检查】 
(1)PH值  本品的1%水溶解,PH值应为4.0~7.0(《中国兽药典》1990年版一部附录29页)
(2)炽灼残渣  不得过10%。(《中国兽药典》1990年版一部附录39页)
(3)干燥失重  取本品0.5g,在80℃减压干燥3小时,减失重量不得过8.0%。
其它应符合粉剂项下的有关规定(附录4页)
【酶活力测定】
底物的制备 菌种为溶酶小球菌(Micrococcus Lysodeiktidus)接种于固体培养基上,置35℃培养48小时,用水将菌体洗下,用纱布滤过,滤液离心后,倾去上层清液,用水洗涤菌体数次,然后用少量水悬浮,冰冻干燥,得淡黄色粉末,供测定用,保存一年。
样品溶液的制备  精密称取本样品4mg,加放于M/10磷酸缓冲液「取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)11.70g,磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)7.86g,乙二胺四醋酸二钠0.372g,加水溶解使成1000ml,PH为6.2」100ml溶解,即得(1ml缓冲液含有溶菌酶40μg)。
另外称取底物(即菌体)10mg,加上述缓冲液4~5ml,在匀浆器内研磨2分钟,倾出,用缓冲液稀释到50ml,悬浮液在25℃时,用分光光度法,按中国药典1977年版附录,在450nm波长处测定吸收度为0.65~0.75时,进行活力测定。
酶活力的测定  精密量取底物悬浮液4ml,放入比色杯中,用分光光度法,按中国药典1977年版附录,在450nm波长处测定吸收度,作为零时读数,然后量取样品溶液0.2ml(相当于8μg溶菌酶),加入比色杯中,迅速混合,用秒表计算时间,每隔30秒测定吸收度,到90秒时共记下四个吸收度读数,根据单位活力定义在25℃,PH6.2,波长450nm时,每分钟引起吸收度下降0.001为一个酶活力单位,按下试计算,即得。
1000
(零时吸收度—60秒时吸收度)×  样品μg数  ×1000=每1mg酶单位数

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